Anatomia genomu człowieka

Dwie główne metody mapowania genów

• Mapowanie genetyczne
  • Pomiar tendencji dwóch genów do bycia przekazywanymi (segregowania) razem w czasie mejozy
  • Przeprowadzane w badaniach rodzin
  • Ustalenie względnego położenia genów
• Mapowanie fizyczne
  • Przypisanie genów specyficznym miejscom na chromosomie
  • Przeprowadzane poprzez badania na komórkach somatycznych i ich materiale genetycznym
  • Potrzebne jest przeprowadzenie pewnych pomiarów fizycznych

Definicje

• Locus (l.mn. loci)- pozycja genu na chromosomie
• Allel - jedna z odmian danego genu - wiele genów ma po kilka różnych odmian dających odmienne fenotypy

Mapowanie genetyczne

• Podstawy zostały opracowane na początku bieżącego wieku przez Morgana
• Pozwala na identyfikację genów, wykrywalnych tylko na podstawie ich efektu fenotypowego
• Można mapować geny nie znając ich funkcji w organizmie ani sekwencji

Mejoza i crossing-over - podstawy sprzężenia

• Tetrady są sparowanymi chromosomami homologicznymi, które w tym stadium składają się z dwóch chromatyd siostrzanych
• W czasie I podziału mejotycznego zachodzi proces crossing-over
• Regiony homologiczne chromatyd niesiostrzanych podlegają wymianie - powstają chromosomy zrekombinowane

Rekombinacja może być zaobserwowana pośrednio

Analizując fenotyp potomstwa można określić, czy rekombincja zaszła, czy też nie.

Sprzężone - dostatecznie bliskie siebie

Zakładając, że proces crossing-over zachodzi w losowo wybranych miejscach chromosomu, to częstość rekombinacji pomiędzy dwoma loci będzie odbiciem odległości pomiędzy tymi dwoma loci genowymi

Sprzężenie genetyczne

• Sprzężenie genetyczne to skłonność dwóch genów do nierekombinowania w czasie mejozy
• Pomiar tej skłonności pozwoliłby na ocenę genetycznej odległości pomiędzy dwoma loci
• Ważne: dwa geny na jednym chromosomie (tzw. synteniczne) nie muszą być sprzężone

Jednostka sprzężenia - 'Morgan'

• Jednostka sprzężenia genetycznego, Morgan, to taka długość genetyczna chromosomu, na której w każdej mejozie zachodzi 1 zdarzenie crossing-over
• Oznacza to, że na tej odległości prawdopodobieństwo wystąpienia crossing-over wynosi 100%
• Centymorgan (cM) = 1% prawdopodobieństwa rekombinacji

Długość genetyczna genomu człowieka

• Genom człowieka ma długość około 3000 cM, a składa się z około 3 miliardów par zasad
• 1 mln bp.z. ~ 1 cM
• Chromosomy mogą mieć około 100-300 cM długości i oznacza to 1 - 3 crossing-over na parę chromosomów w mejozie

Rodowody do analizy sprzężeń

Rodzina, w której chcemy mapować gen musi spełniać pewne kryteria

• Musi być informatywna - oznacza to, że rodzic, który ma allel powodujący chorobę musi być heterozygotą zarówno w locus choroby jak i w locus markerowym
• Musi być znana faza - oznacza to, że musimy wiedzieć jaki jest układ poszczególnych alleli: powodującego chorobę i markerowego

Nieprawdopodobnie skomplikowane prawdopodobieństwa lub wynik LOD

Aby na podstawie rodowodu ocenić, czy dwa loci są sprzężone należy:

• Obliczyć serię prawdopodobieństw, że dwa loci są sprzężone przy różnych wartościach ? (theta) mniejszych od 0,5, gdzie wartość theta=0.00 oznacza, a theta=0,50 - losowy rozdział
• Obliczyć prawdopodobieństwo, że loci te nie są sprzężone (theta>=0.50)
• Logarytm ilorazu tych dwóch wartości daje wartość LOD (ang. logarithm of odds, Z)

Obliczanie wartości LOD

rysunek

Ocena maksymalnego prawdopodobieństwa

• LOD >= 3 (równowartość szans 1000:1 za tym, że dwa locus są sprzężone) uważa się za dowód istnienia sprzężenia dwóch loci (przy danym theta)
• Wartość theta, przy którym LOD jest największy, uważa się za odległość genetyczną pomiędzy tymi dwoma loci

Kilka uwag na temat odległości genetycznej

• Odległości genetyczne są w przybliżeniu addytywne
• Odległość genetyczna (jednostka: Morgan) i fizyczna (jednostka pary zasad) nie są tym samym
• Częstość crossing-over w czasie oogenezy jest około dwa razy większa niż w czasie spermatogenezy

Gen zmapowany

• Zmapowanie genetyczne oznacza, że znamy położenie genu dla danej cechy względem innych genów
• Geny zmapowane genetycznie tworzą grupy sprzężeń wymagające przypisania określonym chromosomom!
• Zmapowanie fizyczne genu oznacza, że znamy lokalizację chromosomową dla danej cechy fenotypowej

Mapowanie - mapa drogowa

rysynek

Fragmentacja genomu

• Nie można zsekwencjonować całego genomu naraz
• Fragmentacja genomu jest etapem początkowym przed przygotowaniem biblioteki klonów

Klony w bibliotece?

• Po fragmentacji genomu poszczególne fragmenty są rozdzielane i umieszczane w tzw. wektorach, które zapewniają możliwość manipulacji i namnażania czyli klonowania w komórkach bakteryjnych
• Biblioteka klonów to zestaw wektorów z insertami obcego DNA uzyskanymi z określonego źródła

Zestawianie klonów

• Po uzyskaniu biblioteki poszczególne klony muszą być uszeregowane we właściwej kolejności czyli w takiej takiej kolejności, w jakiej są w genomie
• W tym celu stosowanych jest kilka metod m.in.:
• mapowanie za pomocą STS
• metoda restrykcyjnego odcisk palca (restriction enzyme fingerprinting)
• Zasada tych metod opiera się na obecności unikatowych sekwencji w poszczególnych klonach - stanowiących rodzaj genetycznych kamieni milowych

Mapowanie za pomocą STS

rysunek

Mapowanie z użyciem STS - 2

rysunek

Odkrywanie genów

Porównanie klonowania funkcjonalnego i pozycyjnego

Klonowanie pozycyjne - kroki

Gen sklonowany

• Gen sklonowany to taki gen, który został wyodrębniony fizycznie z genomu człowieka w postaci określonego odcinka DNA i tym samym jego sekwencja może być poznana
• Sklonowanie genu nie oznacza, że znamy jego funkcję w organizmie - możemy tylko powiedzieć, że istnieje związek przyczynowy pomiędzy mutacjami w tym genie a wystąpieniem określonego fenotypu

Zastosowanie mapowania genomu człowieka

• Pozwala na mapowanie i klonowanie genów powodujących choroby
• Testowanie hipotez dotyczących tła genetycznego chorób
• Informacja diagnostyczna w poradnictwie genetycznym (określenie ryzyka wystąpienia choroby, określenie nosicielstwa patologicznego genu, diagnostyka prenatalna)

FISH

• Mapowanie za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

rysunek

Projekt Poznania Genomu Człowieka

• Projekt Poznania Genomu Człowieka (Human Genome Project, HGP) jest międzynarodowym programem badawczym mającym na celu:
• Skonstruowanie szczegółowych map genetycznych i fizycznych całego genomu człowieka,
• Określenie pełnej sekwencji DNA genomowego człowieka
• Zlokalizowanie wszystkich genów w obrębie genomu człowieka, których liczbę ocenia się na 50 000 do 100 000
• Przeprowadzenie podobnych analiz na genomach organizmów modelowych
• wypracowanie metod przechowywania i udostępniania uzyskanych danych

• HUGO (Human Genome Organisation) -organizacja naukowców zaangażowanych w HGP
• wspiera wymianę danych i odczynników
• Zachęca do rozpowszechniania i dzielenia się technologiami
• Dostarcza informacji n/t różnych aspektów projektów związanych z HGP
• Służy jako pośrednik pomiędzy społeczeństwem naukowców a fundacjami dysponującym środkami na badania